学术分享年冬季广东地区鸡传染

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年冬季广东地区鸡传染性支气管炎病

毒S1基因遗传进化分析

许周懿，吴志强，王占新，覃健萍*

(温氏食品集团股份有限公司，广东云浮)

摘要：为明确年冬季广东省地区鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的流行情况，本研究对广东省地区分离的19株IBV的S1基因进行了遗传进化分析。结果表明：19株分离毒株中有8个QX型分离株（占42.1%）、3个4/91型（占15.8%）、4个HN08型分离株（占21.1%）、2个Mass型（占10.5%）和2个TC07-2型（占10.5%）。19株IBV毒株间核苷酸序列和氨基酸序列一致性分别为65.3%~99.9%和59.8%~98.5%。通过对广东省IBV分离毒株与参考株进行遗传进化分析，发现19株分离毒株S1基因发生较大程度变异。毒株变异为实际生产过程中IB的防控工作带来了更大的挑战，同时也为研制新型疫苗提供了新的方向。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒；S1基因；遗传进化分析；基因同源性

PhylogeneticanalysisofS1geneofavaininfectiousbronchitisvirusisolatedfromsomeareasofGuangdonginthewinterof

XuZhouyi,WuZhiqiang,WangZhanxin,QINJianping*

(WensFoodstuffsGroupCo.Ltd,Yunfu,Guangdong)

Abstract:InordertounderstandtheepidemicvariationofS1geneofavianinfectiousbronchitisvirus(IBV)insomeareasofGuangdongprovinceinthewinterof,theS1geneoffifteenIBVstrainsisolatedfromthreeregionsinGuangdongprovincewasanalyzedforgeneticevolution.TheresultshowedthateightofthenineteenisolatedstrainswereQXtype(42.1%),4/91type(15.8%),HN08type(21.1%),Masstype(10.5%),andTC07-2type(10.5%).Thesimilaritiesofnucleotideandaminoacidsequenceinfifteenisolateswere65.3%to99.9%and59.8%to98.5%.ThroughthegeneticevolutionanalysisoftheIBVisolatedstrainandthereferencestraininGuangdongprovince,itwasfoundthattheS1geneofnineteenisolatedstrainshadalargedegreeofvariation.AlthoughthevariationofthevirusstrainsbroughtbigchallengeforthepreventionandcontrolofIBduringtheproductionprocess,italsoprovidedanewdirectionforthedevelopmentofnewvaccine.

Keywords:IBV;S1gene;phylogeneticanalysis;Genetichomology

鸡传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）是一种急性、高度接触性传染的禽类呼吸道疾病[1]，是国际兽医局（OIE）及我国规定的家禽B/二类传染病之一，其致病原是鸡传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）。传染性支气管炎病毒属于冠状病毒科（Coronavrindac）γ冠状病毒属（Coronavirus），是一种单股正链RNA病毒。IBV基因组容易重组跟变异，产生新的变异株，为该病的防控带来了巨大的挑战。其中S1基因是IBV的基因分型依据，其编码的S1蛋白是IBV产生感染性、致病性的主要免疫蛋白，能够诱导机体产生中和抗体[2-6]，因此通过比较分析分离株的S1基因序列,就能反映流行的IBV基因型与变异趋势,对疫苗选择和疾病防控具有参考价值。本研究对广东省地区分离的19株IBV的S1基因进行了核苷酸序列分析和遗传进化分析，期望为进一步了解鸡传染性支气管炎流行毒株分支生物学特征以及IBV新型疫苗研发奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂

RNA提取试剂盒购自Takara公司；DH5α感受态细胞、去基因组RNA反转试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自天根公司；2XRapidTaqMasterMix购自诺唯赞公司；pMD19T-Vector购自Promega公司；LB肉汤培养基、LB琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2毒株

来源于广东地区的19份病料,采集于疑似感染IBV肉鸡的气管、肺、肾等器官。试验用SPF鸡胚(9～11日胚龄)购自广东新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心。毒株分离信息见表1，参考毒株信息见表2。

表个广东IBV分离株S1基因信息

Table1sourcesandisolationtimesof19isolates

表2参考毒株信息

Table2Thereferencevirussequenceinformation

1.1.3引物设计

参照文献设计S1基因引物如下:

S1-F：5-AAGACTGAACAAAAGACCGACT-3

S1-R：5-CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3

引物由北京华大基因科技有限公司合成,用于扩增IBVS1基因,其序列全长约bp。

1.2方法

1.2.1病毒RNA提取

19株病毒的总RNA抽提按照TakaraRNA提取试剂盒说明书进行，并按照反转录试剂盒的使说明书进行反转录，其产物进行各毒株Ｆ基因的PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测分析。

1.2.2序列测定及同源性分析

选取PCR扩增阳性产物回收纯化，与pMD19T-Vector4℃连接过夜，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，用含氨苄西林的LB固体培养基培养，并进行菌液PCR扩增鉴定，筛选出的阳性菌落送北京华大基因科技有限公司测序，将测序结果与GenBank上已发表的参考毒株的S1基因序列进行比对分析，并根据S1基因核苷酸序列绘制遗传进化树。

2结果

2.1S1基因的PCR扩增结果

经RT-PCR扩增后，凝胶电泳结果显示，19株新城疫病毒S1基因均扩增出与预期目的片段大小一致的片段。

2.2IBV分离株S1基因的遗传进化分析

应用分子生物学软件MEGA5.0对下载的参考毒株和本实验室分离的19株分离株的S1基因的核苷酸序列进行遗传进化树的绘制。通过进化分析发现，19个分离毒株中有8个QX型分离株（占42.1%）、3个4/91型（占15.8%）、4个HN08型分离株（占21.1%）2个Mass型（占10.5%）和2个TC07-2型（占10.5%）。QX型分离毒株又分为ClusterⅠ亚分支（5个，62.5%）、ClusterⅡ亚分支（3个，37.5%）。

详细信息见图1。

图株IBV分离株的遗传进化树

Figure1Phylogenetictreeof19IBVisolates

2.3IBV分离株S1基因的同源性及裂解位点分析

根据本研究的19株IBV的S1基因测序结果，应用生物学软件DNAStar-Megalign将这19株新城疫分离株与GenBank的参考毒株S1基因核苷酸序列及氨基酸序列进行同源性比对分析。结果表明GD/WD46分离株与4/91型参考株核苷酸同源性为97.4%氨基酸为同源性为95.7%，GD/PQD01分离株与4/91型参考株核苷酸同源性为99.6%，氨基酸为同源性为98.7%，GD/WX12分离株与4/91型参考株核苷酸同源性为95.0%，氨基酸为同源性为96.3%；GD/YA22、GD/ZZF2株分离株与Mass型参考株核苷酸同源性为99.8%，氨基酸为同源性为99.6%、95.7%；6株QX型分离株与QX型参考株核苷酸同源性为94.9%~97.2%，氨基酸为同源性为92.8%~96.4%；4株HN08型分离株与HN08型参考株核苷酸同源性为86.2%~88.9%，氨基酸为同源性为82.9%~86.2%；GD/LJF2、GD/CYS45分离株与TC07-2型参考株核苷酸同源性为98.5%、98.0%，氨基酸为同源性为97.8%、96.5%。由本试验19株IBVS1基因核苷酸序列及氨基酸序列分析可知，目前使用的疫苗株与流行的毒株同源性存在较大差异。具体结果见图2图3。

图株毒株与参考毒株的S1基因核苷酸序列同源性比较

Figure2ComparisonofnucleotidesequencehomologyofS1genebetween19strainsandreferencestrains

图株毒株与参考毒株的S1基因氨基酸序列同源性比较

Figure3ComparisonofAminoacidsequencehomologyofS1genebetween19strainsandreferencestrains

3讨论

本研究通过对年冬季广东地区19份临床样品进行病毒分离鉴定，检测到19份IBV阳性样品，其中有8个QX型分离株（42.1%）、3个4/91型（15.8%）、4个HN08型分离株（21.1%）2个Mass型（10.5%）和2个TC07-2型（10.5%）。分离毒株与参考株之间存在较大差异，基于目前研究结果，我们推测S1基因的多样性可能是导致目前免疫失败的一个重要原因。封柯宇等人[5]对我国年到年IBV分离株鉴定发现，QX型占57%，为主要流行基因型，TWⅠ型占17%、4/91型占3%、Mass型占13%、LDT3型占10%。与前人研究结果一致的是，本研究分离的IBV毒株中，QX型仍为主流基因型，其它基因型分离较少但在广东地区持续存在，基于目前的调查结果，我们认为广东地区的IB防控仍需以防控QX型IBV为主，但要兼顾防控其它血清型IBV的流行。

结合目前临床数据显示，我国广东地区以肾型IB为主，并伴随少量呼吸型IB。IB发病季节多为寒冷的冬季，主要诱因包括鸡舍通风不佳，防寒保暖措施不足，消毒不到位等因素。本研究对广东省IBV分离毒株的S1核苷酸序列进行遗传进化分析发现，19株分离毒株与参考毒株之间的同源性差异较大，说明广东地区IBV分离毒株的S1基因在不断发生进化，而且出现了亚分支，给广东地区IB防控带来更大的难题。不同地方的毒株向着不同的基因型进化，呈现出一定的地域性，该结果与其他学者研究结果一致[7,8]。

当前防控IB的主要手段依然是弱毒疫苗免疫，同时需要加强鸡舍消毒和通风管理。弱毒疫苗能诱导机体高效的免疫应答，对目前我国IB防控具有重要的现实意义。但弱毒疫苗在免疫鸡群中可以持续存在，成为IBV重组的供体。因此，有必要对各地区IBV的分子流行病学进行持续性的监测，了解各地IBV分离株与疫苗株之间存在的差异，降低IBV重组的概率，这可能为IBV新型疫苗的研发提供新的思路。

参考文献

[1].Boltz,D.A.,M.Nakai,andJ.M.J.A.d.Bahr,Avianinfectiousbronchitisvirus:apossiblecauseofreducedfertilityintherooster..48(4):p.-.[2].陈彤,刘金,封柯宇.J.中国家禽,-年广西鸡传染性支气管炎病毒S1基因进化分析..41(12):p.22.[3].周海生,etal.,我国-年间鸡传染性支气管炎病毒基因组序列重组分析..12.[4].李鸿鑫,封柯宇,谢青梅.J.养禽与禽病防治,1株台湾型鸡传染性支气管炎病毒的分离与初步鉴定..8.[5].Koch,G.,etal.,Antigenicdomainsonthepeplomerproteinofavianinfectiousbronchitisvirus:correlationwithbiologicalfunctions..71(9):p.-.[6].Cavanagh,D.andP.J.J.J.o.G.V.Davis,CoronavirusIBV:removalofspikeglycopolypeptideS1byureaabolishesinfectivityandhaemagglutinationbutnotattachmenttocells..67(7):p.-.[7].Feng,K.,etal.,EpidemiologyandcharacterizationofavianinfectiousbronchitisvirusstrainscirculatinginsouthernChinaduringtheperiodfrom–..7(1):p.1-11.[8].陈良珂,封柯宇,蔺文成.J.中国家禽,16~年鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学分析..40(15):p.76.

作者简介

许周懿，男，硕士研究生，在温氏食品集团股份有限公司养禽事业部任禽病科研员，主要从事禽病防控研究。

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