生态减负鸡传染性支气管炎弱毒疫苗不同

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本研究目的是：评估传染性支气管炎（IB）弱毒疫苗不同免疫程序，对田间分离的IBV-类QX毒株感染鸡群的保护效果。该实验分为5组：第一组：1日龄免疫传支类QX疫苗；第二组：分别在1日龄和14日龄免疫类QX疫苗；第三组：分别在1日龄和14日龄免疫H和类QX疫苗；第四组分别在1日龄和14日龄免疫H和类4/91疫苗；第五组为攻毒对照组。所有组鸡群攻毒毒株为田间分离类QX毒株，每只鸡攻毒量为.62ELD50/0.1ml。结果统计气管罗音，死亡率，体重，纤毛病变，组织病理学损伤和排毒情况。研究结果显示，所有接种疫苗的鸡在经类QX病毒攻毒后均表现出保护作用。与攻毒对照组相比，活疫苗能明显降低攻毒鸡的气管罗音、纤毛病变和组织损伤。综合分析，四种免疫程序对类QX野毒的保护效果由高到低如下：1d-H+14d-类4/d-类QX+14d-类QX1d-类QX1d-H+14d-类QX。由此可判断，用IBV异源疫苗株加强免疫接种可以保护鸡在感染类QX野毒后免于出现临床症状。

前言

传染性支气管炎（IB）是由冠状病毒引起的

该病毒可以感染呼吸道，生殖道和肾脏。在与其他感染因子如大肠杆菌、MG/MS共同感染时，IB病毒（IBV）感染引起的呼吸系统疾病会加重。IB会导致产蛋下降、蛋壳质量差、高死亡率，目前世界范围内反复出现IB的爆发，如何更有效的防控IB的爆发？成为养禽业急需解决的问题。

一、材料和方法

1.传染性支气管炎病毒：IBV-类QX毒株从田间分离并鉴定为类QX毒株。病毒在9-11日龄鸡胚中繁殖并滴定。使用Reed和Munch的方法计算病毒ELD50。

2.免疫程序设计：只1日龄健康商品肉鸡。随机选20只小鸡进行血液采样，然后安乐处死。剩余只随机分成5组，每组40只。在每组中，小鸡随机分成5个小组，每个小组含有8只小鸡。1-4组执行不同传支免疫程序（表1）；第5组作为攻毒对照未接种IBV疫苗。在28日龄时，所有组的鸡用类IBV-类QX毒株攻毒，实验前和实验期间鸡自由采食。

3.疫苗：该试验中使用的疫苗：类QX疫苗株病毒量-EID50，H毒株病毒量EID50，类4/91毒株病毒含量.6EID50。

4.攻毒处理：所有鸡攻毒毒株为类IBV-类QX野毒。在28日龄时，通过点眼接种μlIBV病毒，每只鸡以.62ELD50/0.1ml的剂量接种。攻毒后连续7天观察所有鸡的临床体征和气管罗音，并在攻毒后7天称重每只鸡。

表1针对IBV类QX毒株（THA）攻毒的不同疫苗接种程序

5.体重统计：各组分别在28天、35天和42天称量体重，并作统计学分析。

6.纤毛病变分数统计：攻毒后7天每组选5只鸡处死。立即取出气管并将其浸入缓冲液中。通过低功率显微镜进行观察。气管分为3个部分（近端、中间和远端），并切成10个环（3个近端，4个中部，3个远端）厚度小于2mm/片。然后将每片气管放入具有缓冲液的24孔板中。通过光学显微镜检查10个环，每个环以0-4的等级如下评分：0（所有纤毛跳动），1（75%纤毛跳动），2（50%纤毛跳动），3（25%纤毛跳动）和4（没有纤毛跳动）。每条气管最高总分为40分（4×10），气管纤毛评分总分小于20，则说明是对免疫程序对该只鸡有保护作用。保护率百分比由公式计算得出：气管得分总计小于20的鸡/组中鸡总数*。得分保护百分比由公式计算得出：1-免疫组纤毛评分平均分数/对照组纤毛评分平均分，此数值越大，说明该免疫程序提供的保护水平就越高。

7.组织病理学检查：攻毒后3、5、7和14天，每组5只鸡被处死。将气管，肺和肾脏的组织固定在10％福尔马林缓冲液中做组织学检查，进行组织病理损伤评分。评分范围为0-3（0：无变化，1：轻度，2：中度，3：重度）。观察气管上皮脱落、上皮变性、嗜异性浸润、上皮增生、淋巴浸润和水肿；观察肾脏的上皮变性、导管扩张、淋巴浸润、上皮再生、淋巴和成纤维细胞增殖；观察肺的淋巴浸润和嗜异性细胞浸润。

8.器官类QX毒株排毒检测：在攻毒后第4、5和6天，收集所有组中的每只鸡的气管、肺、肾和十二指肠样品通过RT-PCR进行IBV检测。这些样品加入10％PBS并混匀，×g下离心10分钟。使用病毒核酸和提取试剂盒收集上清液提取RNA。基于IBV-类QX毒株与H和类4/91的不同序列设计引物进行一步法RT-PCR，反应在48℃进行45分钟，94℃加热5分钟、94℃变性30秒、56℃退火30秒进行35个循环和72℃聚合10分钟扩增检测。通过在1.2％琼脂糖凝胶上电泳分析bp片段的扩增产物，凝胶仪拍照。

9.统计结果：通过ANOVA和Duncan的多重范围测试进行体重和抗体滴度反应的比较。通过Kruskal-Wallis检验比较各组之间的气管罗音，纤毛病变评分，组织病理学评分和排毒检测。当p0.05时显示统计学显著。

二、结果

1.临床症状、死亡率：在用类QX攻毒后，观察临床症状和死亡率。整个实验没有发现自然死亡。但是所有组攻毒鸡都有不同程度的气管病变，免疫组中只有3组（H+类QX）有相对较严重的临床病变；攻毒对照组的临床病变最严重，出现气管病变的鸡只最多。不同免疫程序之间的气管病变程度如下（表2）。

2.体重统计结果：各免疫组鸡体重在35天和42天体重都明显大于对照组体重；免疫组中只有3组（H+类QX）在35天和42天体重明显低于1组、2组（2组体重略高与初始体重高又有直接关系）和4组（表2）。

表2各组攻毒后气管病变统计和28和42日龄平均体重

3.纤毛病变评分结果：纤毛病变评分结果显示各组之间纤毛病变程度有较明显差异，各组病变由轻到重依次为4组（H+类)2组（类QX+类QX）3组（H+类QX）1组（类QX）5组（对照组）。保护率统计结果显示免疫组的每只鸡病变得分都在20分以下，而对照组的纤毛得分平均为30.4分。得分保护率4组（H+）最高为%保护，其他依次为2组（类QX+类QX）、3组(H+类QX)和1组(类QX)，对照组无保护（表3）。

1：保护率：气管得分总计小于20的鸡/组中鸡总数*；

2：得分保护率：1-免疫组纤毛评分平均分数/对照组纤毛评分平均分，此数值越大，说明该免疫程序提供的保护水平就越高。

表3类QX攻毒后7天纤毛病变评分平均分数、保护率及得分保护率

4.气管、肺脏和肾脏的病理损伤病变评分：攻毒后3天、5天、7天和14天每个阶段攻毒组的气管、肺脏和肾脏评分都低于免疫组。综合评估各免疫组之间的气管、肺脏和肾脏的病变评分，各免疫组鸡的病变轻重依次为4组2组3组1组。（表4）。

表4类QX攻毒后3、5、7和14天的气管、肺脏和肾脏的组织病理学评分平均数

5.气管、肺脏、肾脏和肠道检测类QX毒株排毒情况：通过RT-PCR方法用类QX毒株特异性引物进行传支排毒检测。结果发现气管是IBV检测率最高的器官。攻毒后第4天（32日龄），在肠道中检测不到IBV。攻毒后第5天（33日龄），几乎所有组别的鸡IBV检测次数有所减少。只有阳性对照组在攻毒后6天一直能检测到IBV。攻毒后第6天，仅在气管和肺脏中能检测到IBV。各免疫组检出阳性数量由少到多依次为：4组2组1组3组（表5）。

表6攻毒后第4、5、6天RT-PCR检测类QX野毒在各器官排毒情况

三、讨论

该实验旨在通过评估鸡气管啰音、体重、纤毛评分、组织病理学评分和器官排毒，研究不同IB疫苗接种程序对IBV-类QX毒株株攻毒的保护效果。攻毒后3-7天，免疫组和攻毒对照组均可检测到气管啰音，但未发现死亡鸡。结果显示，用不同IBV血清型疫苗的二次接种，可以加强针对异源IBV血清型感染的保护。接种IBV弱毒疫苗可刺激细胞介导的免疫，以保护IBV-类QX攻毒后气管粘膜免受损伤。用异源疫苗株加强免疫可减轻攻毒后的临床症状，但商业化养殖场饲养密度大、环境应激及其他病原微生物混合感染，可能会导致较高的死亡率。免疫组的纤毛病变，平均得分显示1日龄免疫H+14日龄免疫类4/91对类QX能提供％保护，而两次免疫类QX疫苗则保护率只有89.47%（表3），说明保护型疫苗株加强免疫，可以保护鸡免受IBV异源毒株的攻击。

临床病理学观察显示，类QX对感染鸡的气管损伤最严重。攻毒后第14天，由于气管，肺和肾的组织病理损伤逐渐减轻，鸡可能从感染中慢慢恢复。这可能是由于抗IBV感染的局部细胞免疫导致的。疫苗接种会减少感染并减轻IBV攻毒的临床症状。接种疫苗后，细胞毒性T细胞在抗IBV感染中发挥作用。IB疫苗可通过细胞毒性T细胞反应降低早期感染和临床症状。细胞毒性T细胞活性主要是指组织相容性复合物，由CD8+CD4-细胞介导。这种机制有助于减轻攻毒后14天的组织病理学损伤。与其他疫苗免疫程序相比，4组（1d-H+14d-类4/91）中的鸡具有最轻微的组织病理学损伤。RT-PCR检测结果显示，气管是具有较高病毒数量的器官。和其他研究观点相同，鸡群在感染后的第3至5天呼吸道IBV浓度最高，此后，病毒滴度在第2周时迅速下降至检测水平以下。通过RT-PCR进行IBV检测显示气管是用来分离IBV最合适的组织。

本实验中的所有免疫程序，都可以降低感染鸡群的气管罗音，纤毛病变和组织病理学损伤，都表现出不同程度的保护效果。综合分析，四种免疫程序对类QX野毒的保护效果由高到低如下：1d-H+14d-类4/d-类QX+14d-类QX1d-类QX1d-H+14d-类QX。由此可判断，用IBV异源疫苗株加强免疫接种，可以保护鸡在感染类QX野毒后，免于出现临床症状。

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